• 關於myf-5(肌肉調節蛋白)、troponin(肌肉結構蛋白)、cmlc(心臟肌結構蛋白)及rhodopsin(視網膜受光蛋白)的分子結構、基因調控、轉錄表現及功能分析。
• 利用基因轉殖魚作為模式動物研究人類疾病(心臟及眼睛)。
• 研發水產養殖生物(魚、蝦、貝、餌料生物)之基因轉殖系統及新品系。
• 開發各類觀賞魚種多樣化的體色。

(A) 魚類肌肉形成的分子調控機制、胚胎發育的表現及功能 :

(a) 斑馬魚肌肉分化的調控蛋白 myf5 基因

Myf5 是在胚胎時期控制 somite 中肌肉細胞的 specification 及 differentiation 的調控蛋白。因此，研究這個蛋白的調控機制及 胚胎發育時的基因表現及功能 ，不僅在學術上十分重要，而且也可應用來增加魚類肌肉的質及量。本人在國科會的支持下，在 Myf5 的研究五年內完成下列主要成果 :

1) 發現 myf5 基因上游 -82/-62 為 somite-specific 的 cis -element 及其結合的 trans -factors FoxD3 和 FoxD5: 探討魚類 myf5 基因的分子結構及胚胎發育時的動態表現 ; 並且利用基因轉殖的方式在 in vivo 的條件下微細地解析 myf5 基因上游近端重要調控專一性的序列而發現 myf5 基因上游的 novel -82/-62 motif 是個 myf5 之 somite-specific expression 的重要序列，進而利用 yeast one-hybrid 的方法找到所結合的 transcription factor Foxd3; 因而提出影響肌肉體節發育的機制是經過 Pax3-FoxD3-Myf5 的途徑模式 (Lee et al., 2006) 。進一步地，我們更發現 Fox 家族的另一個成員 FoxD5 在維持體節前後極性與表皮化的過程中是必需的，而且 FoxD5 在 anterior PSM 的表現主要是受到 Fgf signaling 調控，而發現在體節形成過程當中 Fgf-FoxD5-Mesps 這條訊息傳遞網絡 (Lee et al., 2009) 。由於此項研究成果本人將受邀到 2011 年在德國召開的 2 nd EMBO Congress on “The molecular and cellular mechanisms regulating skeletal muscle development and regeneration” 演講。

2) 發現一種會抑制 myf5 表現的新型 intronic microRNA: 我們第一個發現 myf5 的 intron I 內含有一個新型會抑制其表現的 cis -element 存在，並獲知此抑制作用是 orientation- 和 myf 5-specific; 接著我們証實此 intron I 對 myf 5 基因表現的負向調控是藉著 RNA 分子而發現了一種 novel 的 intronic microRNA ( 稱為 miR-In300) 所主控。本實驗室更研發一種最快速、最有效、稱為 La beled m icroRNA p ull-down assay system(LAMP) 尋找 microRNA 目標基因的方法 (Hsu et al., 2009)( 此方法已被 Dr. Goodchild 邀請寫一個 Chapter 收錄在 Humana Press, USA, 所出版的 "Methods in Molecular Biology") 。此方法讓我們找到了 miR-In300 的目標基因即 dickkopf-3 ( dkk3 ) 基因，而新發現了 miR-In300 會透過默化 dkk3 而造成抑制肌肉調控因子 myf5 基因在斑馬魚胚胎肌肉發育時的表現 (Hsu et al., 2010) 。進一步發現抑制 dkk3 會造成磷酸化的 p 38a 蛋白質下降； knockdown p 38a 的表現後，發現 myf5 表達較低少，證明 p 38a 是經由磷酸化作用來調控 myf5 啟動子的活性。當注射 p 38a -MO 到帶有 myf5 上游 80kb 啟動子驅動 GFP 的斑馬魚轉殖品系 Tg(myf5(80K):GFP) 之胚胎後，會造成 myf5 啟動子驅動 GFP 的表現能力下降。另一方面，加入 dominant negative form 的 Smad2 及 Smad 3a 後 myf5 表現下降。利用 CIP assay 證實 Smad 3a 可直接結合到 myf5 啟動子上，藉由 Smad2/ 3a complex 開啟 myf5 。而當抑制 Dkk3 或 p 38a 時， Smad4 蛋白質表現會下降而 Smad3 蛋白質量不改變；且過量表現 smad4 可以挽救 dkk3-MO 造成 myf5 下降的情形。總結 Dkk3 藉由調控 p 38a 的磷酸化來維持 Smad4 蛋白質穩定性，進而使 Smad4 能與 Smad2/ 3a 形成 complex 來開啟斑馬魚 myf5 的啟動子 (Hsu et al., 2011) 。

3) 定出 myf 5 基因上游 -150 kb 會影響 myf5 表現的重要 cis -elements 並建立轉殖品系 : 以 transgenic lines 策略詳細分析 myf 5 基因上游遠端 -150 kb 內各 cis -element 負責調控 myf5 表現的角色 ; 並成功地利用 BAC clone 技術得到含有上游 -150 kb 之 myf-5 :gfp 的轉殖品系，其可以 mimic 這種 somite-specific 及 stage-dependent 的 myf5 基因的表現 (Chen et al., 2007) 。進一步地對 mrf4 及 myf 5 兩 個鄰近相關基因之 loci 進行解析而揭開這個肌肉調控蛋白基因錯綜複雜的調控機制，並且確立兩型 mrf4 的生物功能各與 myofibril alignment 及 motor axon growth organization 有關 (Wang et al., 2008) 。因此，本人受 Journal of Fish Biology 期刊之邀，寫了一篇有關魚類 Myf5 及 MRF4 基因調控的 review article (Chen and Tsai, 2008) 。

4) 發現 myf 5 基因參與頭部及顏面肌肉發育的任務與參與軀幹部肌肉發育的任務並不相同 : 本實驗室先證明了 Myf5 調控蛋白除了負責軀幹體節發育之外，也參與頭部及顏面肌肉的發育，並獲知 Myf5 在頭部肌肉及軟骨發育的功能與 Myod 可完全獨立 , 但不可取代 , 並提出 Myf5 及 Myod 互動的三種可能的分子調控途徑 (Lin et al., 2006) 。進一步地，我們發現了 six 1a 基因在 Myf5 及 Myod 互動的調控中所?任的關鍵角色 (Lin et al., 2009) 。這項研究開啟了魚類頭部肌肉及軟骨發育重要領域之研究先端 , 將會對人類顏面肌肉及骨骼發育的暸解有所幫助。

(b) 斑馬魚肌肉結構蛋白 troponin 基因的分子結構及在胚胎中的動態表現

Troponin 是肌肉重要的結構蛋白 ; 共有 T 、 C 、及 I 三型；同時又分心臟、慢肌及快肌三種 isoforms 。本實驗室除了研究斑馬魚 troponin T 三種 isoforms 之外，近年來則著手解析 troponin I 各種 isoforms 它們的分子結構、演化及在胚胎發育時動態表現而發現一種會從頭部表現再轉移到心臟表現的 troponin I 的新發現 isoform (Fu et al., 2009) 。這些成果是將來利用斑馬魚當模式動物研究心臟衰竭或疾病的重要依據。

5) 肌肉專一表現的 miR-1 與 miR-206 在發育中 target 不同基因的分子機制

在 microRNA 的研究中，以往認為具有相同 seed sequence 的 microRNA 會辨識相同的 target 。由於 miR-1 與 miR-206 具有相同的保守性 seed sequence ，所以目前常推測兩者共同調控相同的下游基因。但我們在 miR-1 透過結合 seryl-tRNA synthetase ( sars )-3'-UTR 調控 Sars 表現量，進而影響血管生成的研究中，我們證實了 miR-1 與 miR-206 對目標基因 3'-UTR 結合是具有專一性的。其中 sars- 3'-UTR 是專一受到 miR-1 所結合，而 vegfaa- 3'-UTR 是專一受到 miR-206 所結合調控。且 miR-1 與 miR-206 對血管生成上是扮演相反的作用，不可再被歸論為同一功能。並且以實驗證實發現 microRNA 結合位置除 seed sequence 外，非 seed sequence 的結合序列也對結合的專一性與結合能力扮演關鍵角色。

(B) 建立基因轉殖魚在生物醫學的應用 :

(a) 心臟帶有 GFP 之基因轉殖魚在心臟醫學上的研究

本實驗室於 2003 年首次發表可以整個心臟被綠螢光 (GFP) 標誌的轉殖魚穩定遺傳品系 ( 已獲中華民國發明 第 I 245799 號專利及 美國專利 US7355095B2) 。這個轉殖魚在心臟病發生的分子機制 , 心臟病的模式動物及藥物的篩選有很大的貢獻 ( 例如發表這個螢光心臟品系的 Huang et al., 2003, 這一篇文章至今已被他人引用 83 次 ; 自我引用 7 次 ) 。近五年來，本實驗室仍繼續研究這主題，其成果如下 :

1) 建立可以誘導外來基因只在心臟專一表現的轉殖魚品系 : 本實驗室與台大醫院臨床醫學所謝豐舟教授及心臟科何奕倫醫師合作建立第一個斑馬魚類心臟的分子影像、心室收縮功能測定及心跳動圖 (Ho et al., 2007) 。因此，我們利用它為基礎，接著又成功地在斑馬魚活體上 ( 胚胎、幼魚或成魚 ) 建立一種可以隨時由 inducer 誘導後會降低 cardiac troponin C 蛋白而造成 dilated cardiomyopathy (DCM) (Ho et al., 2009) 。此項研究 DCM 最新的動物模式，頗受日本心臟醫學科學家之肯定 (Ohte et al., 2009) 。

2) 瞭解影響魚類心臟早期發育的基因及其功能 : 我們研究 GSK3α 和 GSK3β 兩型在心臟及血管早期發育時的所?任不同的角色，發現 GSK3α 是負責維持心臟 cardiomyocyte 細胞的存活而 GSK3β 是負責左移及心房心室的 looping (Lee et al., 2007) 。最近 , 我們更發現 Nkx2.5 及 Nkx2.7 在心臟形成時功能可以互補 , 但 Nkx2.7 會透過 調控 tbx5 及 tbx20 的表現來參與心臟晚期的形成 , 任務較重要 (Tu et al., 2009) 。另一方面，本實驗室也與 NYU 的 Prof.Yelon 合作發現 Semaphorin3D 擔任心臟發育早期時 cardiac neural crest cells 進入 primary heart field 的關鍵功能 (Sato et al., 2006); 繼而我們也發現在心臟發育早期 heart tube assembly 時 cardiomyocyte 的遷移需要 endocardium 的參與 (Holtzman et al., 2007) 以及區域性細胞形態的改變會控制心臟早期的形成 (Auman et al., 2007) 。

3) 魚類心臟在最原始時期跳動的機制 : 本實驗室與 Caltech 的 Prof. Gharib 合作研究發現早期的心臟管細胞的移動及血流會造成一個為期 590m s 收縮週期的波動，這個波動開始於靠 inflow tract 附近的 pacemaker 位置；每一個 cycle 結束前都會造成 suction bolus 而吸引血流入心臟管。所以是一種動態性的 suction pump ，於是提出了 hydro-impedance pump 的 model ( 這個 model 不同於大家過去以為的 peristaltic pump 的 model) ( Forouhar et al., 2006) 。

(b) 其他基因轉殖魚品系在生物醫學的研究

除了上逑心臟帶有 GFP 之基因轉殖魚 , 我們也建立其他轉殖品系，例如帶有 myf5 、 rhodopsin 、 troponin 、 keratin 18 、 α- 和 s-actin 基因大大小小上游序列的 DNA 片段，能主控開啟 tissue-specific 的螢光蛋白的報導基因。這些具有特殊遺傳基因品系的轉殖魚可以做為基礎醫學和分子生物學的研究的新材料外 , 也可以作為研究人類遺傳疾病（眼睛、肌內、皮膚）的動物模式。

1) 眼睛帶有綠螢光 GFP 之斑馬魚轉殖品系 : 本實驗室與台大眼科楊長豪醫師、胡兆宇醫師合作，利用斑馬魚當材料來研究眼睛的發育及疾病 , 發現當調控核蛋白 Egr1 缺乏時會造成眼晴視網膜及水晶体分化不全而出現小眼症 microphthalmos (Hu et al., 2006) 。進一步，我們也發現了膜蛋白 ADP-ribosylation factor-like 6 interacting protein 1 (Arl6ip1) 缺乏時會影響視網膜的前軀細胞離開細胞的週期而無法分化，造成眼睛發育嚴重受阻 (Huang et al., 2009) 。

2) 皮膚帶有紅螢光 RFP 之斑馬魚轉殖品系 : 本實驗室成功地尋找到皮膚特有的 keratin 18 基因 , 除了瞭解分子結構、演化及在胚胎發育時動態表現，並把它與 RFP 紅螢光結合後建立一種會產生紅螢光表皮的基因轉殖品系 (Wang et al., 2006a ) 。當這個品系之胚胎浸泡在含砷的溶液，即可輕易見到皮膚那一個地方產生 tumor (Wang et al., 2006b). 這個品系勢必有助於將來研究 skin cancer 、篩選藥物或環境污染的模式實驗動物。進一步地我們更詳細分析了 keratin 18 基因上游序列，獲知 -141/+85 為 skin-specific 的關鍵序列 (Wang et al., 2006c ) 。

3) 處於環境逆境時表現 GFP 之 huORFZ 斑馬魚轉殖品系

當生物處於逆境而造成蛋白質摺疊異常時便會引發內質網壓力 (ER stress) ，而 Chop/Ditt3 為生物體對內質網壓力做出反應時所需的關鍵蛋白質之一。目前已知 Chop 蛋白質之合成除了受轉錄層次之調控外，位於 chop mRNA 5'-UTR 之 open reading frame (uORF chop ) 之轉譯抑制特性也扮演重要的角色。因此與一般使用特定基因之 promoter 控制報導基因轉錄之策略不同，本實驗室藉由結合人類 chop 基因之 uORF chop 與 GFP 報導基因而達成於轉譯層次上控制綠螢光訊號之結果。我們同時發現此 huORFZ 品系斑馬魚可對多種環境毒物與逆境產生反應而表現出具有組織特異性之綠螢光訊號。 huORFZ 除了用於研究 uORF 之分子機制外，也具有作為第一線環境監測工具的潛力。

(C) 開發魚類胚胎之分子影像

生物分子影像 (Biomolecular imaging) 新技術的研發 , 將成為未來生物醫學 ( 包括胚胎發育學 ) 研究的利器。本實驗室與台大電機系光電所 孫啟光 教授開發了以魚類胚胎為活体的分子影像技術 , 即利用 modified optical scanning microscope 及 Cr:forsterite laser microscope 之 harmonics 雙倍頻雷射顯微鏡，以非侵入性方式直接觀察斑馬魚胚胎的各細胞、組織或器官 (Tsai et al., 2006); 甚至於可以長期觀察神經發育時成的動態變化 (Chen et al., 2006) 。進一步地， 孫 教授又開發了新型 Harmonic Generation Microscopy combined with Two-Photon Fluorescence Microscopy ( HGM/2PF) 再配合我們心臟螢光轉殖魚品系可以直接活體觀察到瓣膜及其形成 (Chen et al.,unpublished data) 。最近， 本實驗室也與台大醫學院醫工所 劉子銘 教授合作利用 harmonics optical microscopy 細部觀察斑馬魚活體胚胎體節分節過程中細胞的變化，藉探討特定基因對胚胎體節發育的影響 (Lee et al., 2009) 。同時， 本實驗室也與加州 Caltech 的 Biological Imaging Center, Prof. Liebling 研發成功可以直接觀察斑馬魚心臟在胚胎中各發育階段時其形態及功能之動態變化的 4D 分子影像 (Ohn et al., 2009) 。

( D) 水產分子生物技術的研究 : 開發經濟魚、貝類及餌料生物 ( 微細藻和豐年蝦 ) 之轉殖技術及 在 水產 養殖上的 應用

1 ) 九孔精子載體法轉殖技術 : 大部份的經濟魚類、蝦類及貝類的授精卵及其早期胚胎發育的特性並十分清楚，因而會造成在基因轉殖上的困難。若能利用這些經濟水產動物的精子當作攜帶外來基因片段的載體，許多困難應可迎刃而解，但精子載體法尚有許多爭議。本實驗室成功地開發九孔轉殖中最簡便、有效的 ” 精巢直接轉殖法 ”(Chen et al., 2006) 。由於這些研究的成果，使得利用精子載體法轉殖外來基因片段到鮑魚類有個標準且容易可行的技術平台 ( 這項創新技術更獲 World Aquaculture 雜誌特別刊登報導 ) 。

2) 微細藻電穿孔法轉殖 技術的 建立及穩定遺傳轉殖品系在養殖上的應用 : 在水產養殖業中，剛孵化的魚、蝦、貝類幼苗由於消化系統分化不全，大多數無法消化及代謝人工飼料，因此選用適當的天然浮游生物當活體餌料生物，將有助於提供種苗充足的營養與提高育成率，因而成為決定養殖成敗的關鍵技術。 擬球藻 ( Nannochloropsis oculata ) 目前被廣泛使用在台灣的海水經濟 魚、蝦、貝類 種苗的天然餌料之ㄧ ，但其分子轉殖的研究尚未建立。本實驗室已成功地利用電穿孔法 (electroporation) 配合 synthetic gastric acid 的處理及用天然的紅螢光蛋白當 selection marker 而建立了擬球藻最適化的之基因轉殖條件 (Li and Tsai, 2009) 。建立好擬球藻之基因轉殖並成功篩選到能穩定遺傳外來的魚類生長蛋白基因及抗菌基因的品系。這些品系能表現轉入基因的功能 , 經餵食或以食物鏈方式可使吃擬球藻的吳郭魚幼魚的成長速度顯著增加 -- 例如與控制組的淨增重相化為 316 % vs.104 % (Chen et al., 2008) 或者可以增加抵抗海洋弧菌 ( Vibrio parahaemolyticus ) 感染的能力 -- 例如與控制組的活存率相比為 85% vs. 5% (Li and Tsai, 2009) 。特別是利用微細藻當生物反應器生產 antimicrobial peptide 而直接餵食幼魚這種餌料生物，可以大大降低抗生素在水產養殖的使用量。另外，擬球藻本身又是無性生殖，也大大降低 GMO 對環境所造成的可能風險。因此建立好這種微細藻的轉殖技術平台會有助於將來利用它作為健康食品、??及生質能源的新材料 ( 此研究成果獲 8th Asia-Pacific Marine Biotechnology Conference 得優秀壁報展銀牌獎 ) 。

3) 豐年蝦 轉殖 技術的 建立 及 穩定遺傳轉殖品系在養殖上的應用 : 甲殼類豐年蝦 ( Artemia ) 的無節幼蟲，是最廣泛被利用於餵食養殖魚蝦貝類的活體餌料生物。我們利用電穿孔轉殖豐年蝦共 24,054 顆卵，經篩選進而與野生型進行配對後得到 F1 ，進行近親自交得到 F2 ，最後成功篩選出 2 株含有黃鰭鯛生長蛋白之遺傳穩定轉殖品系 (A3 及 A8) 。經 SDS-PAGE ，西方轉漬法，及 LC-MS 蛋白質定序分析後，證實轉殖豐年蝦能產重組黃鰭鯛生長蛋白 (rGH) 。經 ELISA 測定 50 隻來自轉殖豐年蝦 A3 及 A8 homozygotic 品系的無節幼蟲，其所含重組黃鰭鯛 rGH 分別為 0.089μg 及 0.032μg 。進一步地，分別施予每日餵食 10 隻野生型或轉殖豐年蝦斑馬魚的幼魚，連續餵食十天後，結果顯示餵食轉殖組其平均體長比野生型組高出 15.5% 。因此，我們成功地建立一種可以穩定表達外來基因的轉殖豐年蝦品系，且能經簡單地經過口服方式而達到促進魚苗生長的目標 (Chang et al., 2011) 。

4) 建立 穩定遺傳抗菌蛋白之 斑馬魚 轉殖品系及在養殖上的應用 : 由於斑馬魚體型小，性成熟快，一年四季皆可產卵，卵大且透明，數量多，易於操作，培養，是做為低成本生物反應器的最佳選擇 ; 而牛的乳鐵蛋白具有抗各種微生物能力的廣效性 抗菌蛋白 。我們成功地建立以斑馬魚本身或魚卵作為生物反應器來生產乳鐵抗菌蛋，並且篩選到高量表現這種抗菌蛋白的 穩定遺傳 品系，即ㄧ個 72-hpf 之第二代 (F2) 轉殖魚魚卵所含有的 lactoferrin 相當於 0.1μg 的 Ampicillin 殺 Escherichia coli 的效力 ; 並證明被餵食這種轉殖魚卵的魚能有效抵抗水產養殖常見的病菌 Aeromonas hydrophilia 和 Edwardsiella tard a 的感染 (Lin et al., 2010) 。這個策略將可降低水產養殖上使用抗生素的另一途徑。

5) 建立轉殖魚品系作為觀賞水族的新材料 -- 全身性會發螢光的轉殖觀賞魚 : 本實驗室利用分子生物科技來改變魚類成特殊遺傳品系，使得這種熱帶魚類有了多樣性的色澤，因而大大地提高該魚種的觀賞價值及國際競爭力 ( 已獲中華民國發明 第 I 227735 號專利 ) 。同時又致力於研究基因轉殖魚之子代變成沒有孕育的能力，避免破壞環境生態。這種全身性可發螢光的觀賞魚品系已成功地推廣至民間企業，使台灣成為世界上第一個能上市這種不會破壞生態環境之水族科技寵物的國家，替國家賺取外匯並提昇國家科技實力及形象。該項成就除國內媒體報導之外，也在國外報章雜誌刊登及媒體報導，例如 Discovery 、 Animal Planet 、 法國第三電視台、日本朝日電視台，並當選 Time 雜誌 2003 年最酷發明之一。同時，螢光魚的題材也被列入教科書內，例如 Thomson Brooks/Cole 出版的 Biotechnology: An Introduction （ 2 nd edition,2005 ）在第 8 章由 Miami 大學 Susan Barnum 教授主筆的 Marine biotechnology 中的「 Biotech Revolution: Fluorescent Fish Pets 」就有詳細介紹。還有，我國高中及高職生科教材也放入這個題材。

6) 新種色澤基因轉殖觀賞魚品系的開發

藉由轉殖螢光蛋白基因使魚類產生獨特的色彩所開發出的螢光觀賞魚，可提升魚種的觀賞價值及國際競爭力。然而目前可被應用的螢光蛋白多屬於綠色與紅色系，藍紫色系的色彩甚為稀少。因此我們從色彩鮮豔的海洋生物中篩選出色澤蛋白，藉著分子生物技術獲得其基因序列，進而獲得新種的藍紫色色澤蛋白基因。此外我們也利用突變技術改變色澤蛋白基因，使得突變型色澤蛋白能表現出各種新穎的色彩。目前我們已開發出具藍、紫、粉紅色系的色澤蛋白並加以應用於觀賞魚分子育種中。

→ 魚類分子生物與生物技術研究室首頁

2. Chen, Y. H. and H. J. Tsai* 2002. Treatment with Myf5-morpholino results in somite patterning and brain formation defects in zebrafish. Differentiation, 70: 447-456. (SCI Journal)

3. Ho, Y. L., Y. H. Shau,H. J.Tsai, L. C.Lin, P. J. Huang and F. J. Hsieh* 2002. Assessment of zebrafish cardiac performance using doppler echocardiography and power angiography. Ultrasound Med. Biol., 28: 1137-1143. (SCI Journal)

4. Wang, T. M., Y. H. Chen, C. F. Liu and H. J. Tsai* 2002. Functional analysis of the proximal promoter region of fish rhodopsin and Myf-5 genes using transgenesis. Marine Biotechnol., 4: 247-255. (SCI Journal)

5. Hsiao, C. D., W. Y. Tsai and H. J. Tsai* 2002. Isolation and expression of two zebrafish homologous of parvalbmin genes related to chicken CPV3 and mammalian oncomodulin. Mech. Dev., 119S:S161-S166. (SCI Journal)

6. Hsiao, C. D., W. Y. Tsai, L. S. Horng and H. J. Tsai* 2003. Molecular structure and developmental expression of three muscle-type of troponin T genes in zebrafish. Dev. Dynamics, 227:266-279. (SCI Journal)

7.  Huang, C. J., C. T. Tu, C. D. Hsiao, F. J. Hsieh and H. J. Tsai* 2003. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev. Dynamics, 228:30-40. (SCI Journal)

8. Chen, Y. H., H. C. Lee, C. F. Liu, C. Y. Lin and H. J. Tsai* 2003. Novel regulatory sequence -82/-62 functions as a key element to drive the somite-specificity of zebrafish myf-5. Dev. Dynamics, 228:41-50. (SCI Journal)

9. Hsiao, C. D. and H. J. Tsai* 2003. Transgenic zebrafish with fluorescent germ cells: a useful tool to visualize germ cells proliferation and juvenile hermaphroditism in vivo. Dev. Biol., 262:313-323. (SCI Journal)

10.  Raya, A., C. M. Koth, D. Buscher, Y. Kawakami, T. Itoh, R. M. Raya, G. Sternik, H. J. Tsai,   C. Rodriguez-Esteban and J. C, Izpisua-Belmonte* 2003. Activation of Notch signaling pathway precedes heart regeneration in zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,100: 11889-11895. (SCI Journal)

11.  Shu, X., K. Cheng, N. Pate, F. Chen, E. Joseph, H. J. Tsai and J. Chen*. 2003. Na, K-ATPase is essential for embryonic heart development in the zebrafish. Development, 130:6165-6173. (SCI Journal)

12.  Hsiao, C. D., M. Ekker and H. J. Tsai* 2003. Skin-specific expression of ictacalcin, a homolog of the S100 genes during zebrafish embryogenesis.Dev. Dynamics, 228:745–750. (SCI Journal)

13.  Chu, S. W., T. M. Liu, C. K. Sun,* C. Y. Lin and H. J. Tsai. 2003. Real-time second- harmonic- generation microscopy based on a 2-GHz repetition rate Ti:sapphire Laser. Optics Express., 11:933-938. (SCI Journal)

14.  Chu, S. W., S. Y. Chen, T. H. Tsai, T. M. Liu, C.Y. Lin, H. J. Tsaiand C. -K. Sun.* 2003. In vivo developmental biology study using noninvasive multi-harmonic generation microscopy. Optics Express., 11:3093-3099. (SCI Journal)

15. Tsai, H. J. * 2003. Transgenic fish: research and application. J. Fish. Soc. Taiwan, 30:263-277 (invited review article)

16. Sun, C. K.,* S. -W. Chu, S.-Y. Chen, T.-H. Tsai, T.-M. Liu, C. -Y. Lin and H. J. Tsai. 2004. Higher harmonic generation microscopy for developmental biology. J. Struct. Biol., 147: 19-30 (SCI Journal)

17. Lin, C. Y., Y. H. Chen, H. C. Lee and H. J. Tsai*. 2004. Novel cis-element in intron 1 represses somite expression of zebrafish myf-5. Gene, 334:63-72. (SCI Journal)

18. Huang, C. J., T. S. Jou, Y. L. Ho, W. H. Lee, Y. T. Jeng, F. J. Hsieh and H. J. Tsai*. 2005. Conditional expression of a myocardium-specific transgene in zebrafish transgenic lines. Dev. Dynamics, 233:1294-1303 (SCI Journal)

19. Wang, Y. H., Y. H. Chen, J. H. Lu and H. J. Tsai*. 2005. A 23-amino-acid residue spanning the basic domain targets zebrafish myogenic regulatory factor Myf-5 into nucleolus. DNA Cell Biol. 24: 651-660. (SCI Journal)

20. Chen, H. L., H. S. Yang, R. Huang and H. J. Tsai*. 2006. Transfer of a foreign gene to Japanese abalone (Haliotis diversicolor supertexta) by direct testis-injection. Aquaculture, 253:249-258. (SCI Journal)

21. Lee, H. C., H. Y. Huang, C. Y. Lin, Y. H. Chen and H. J. Tsai*. 2006. Foxd3 mediates zebrafish myf5 expression during early somitogenesis Dev. Biol. 290:359-372 (SCI journal)

22. Wang, Y. H., Y. H. Chen, Y. J. Lin and H. J. Tsai*. 2006. Spatiotemporal expression of zebrafish keratin 18 during early embryogenesis and the establishment of a keratin 18:RFP transgenic line. Mech. Dev.:Gene Expression Patterns 6:335-339. (SCI journal)

23. Tsai, T. H., C. Y. Lin, H. J. Tsai, S. Y. Chen, S. P. Tai, K. H. Lin and C. K. Sun*. 2006. Biomolecular imaging based on far-red fluorescent protein with a high two-photon excitation action cross section. Opt. Lett. 31: 930-932. (SCI Journal)

24. Wang, Y. H., Y. H. Chen, J. H. Lu, Y. J. Lin, M. Y. Chang and H. J. Tsai*. 2006. Epidermis-restricted expression of zebrafish cytokeratin II is controlled by a -141/+85 minimal promoter, and cassette -141/-111 is esential for driving the tissue-specificity. Differentiation 74:186-194. (SCI journal)

25. Wang, Y. H., Y. H. Chen, T. N. Wu and H. J. Tsai*. 2006. A keratin 18 transgenic zebrafish Tg(k18(2.9):RFP) treated with inorganic arsenite reveals visible overproliferation of epithelial cells. Toxicol. Lett. 163:191-197. (SCI journal)

26. Sato, M., H. J. Tsai and H. J. Yost*. 2006. Semaphorin3D regulates invasion of cardiac neural crest cells into the primary heart field. Dev. Biol. 298: 12-21. (SCI Journal)

27. Chun, C. Z., H. J. Tsai and T. T. Chen*. 2006. Trout Ea4- or Human Eb-Peptide of Pro-IGF-I disrupts heart, red blood cell, and vasculature development in zebrafish embryos. Mol. Reprod. Dev. 73:1112–1121. (SCI Journal)

28. Forouhar, A. S., M. Liebling, A. Hickerson, A. Nasiraei-Moghaddam, H. J. Tsai, J. R. Hove, S. E. Fraser, M. E. Dickinson and M. Gharib*. 2006. The embryonic vertebrate heart tube is a dynamic suction pump. Science 312: 751-753 (SCI Journal)

29. Sabaawy, H. E., M. Azuma, L. J. Embree, H. J. Tsai, M. F. Starost and D. D. Hickstein*. 2006. TEL-AML1 transgenic zebrafish model of precursor B cell acute lymphoblastic leukemia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 15166-15171. (SCI Journal)

30. Lin, C. Y., R. F. Yunag, H. C. Lee, W. T. Chen, Y. H. Chen and H. J. Tsai*. 2006.Myogenic regulatory factors Myf5 and Myod function distinctly during craniofacial myogenesis of zebrafish. Dev. Biol. 299: 594-608. (SCI Journal)

31. Hu, C. Y., C. H. Yang, W. Y. Chen, C. J. Huang, H. Y. Huang, M. S. Chen and H. J. Tsai*. 2006. Egr1 gene knockdown affects embryonic ocular development in zebrafish. Mol. Vision 12: 1250-1258. (SCI Journal)

32. Chen, S. Y., C. Hsieh, S. Chu, C. Y. Lin, C. Ko, Y. Chen, H. J. Tsai, C. H. Hu and C. K. Sun*. 2006. Noninvasive harmonics optical microscopy for long-term observation of embryonic nervous system development in vivo. J. Biomed. Opt. 11: 054022-8. (SCI Journal)

33. Chen, Y. H., Y. H. Wang, M. Y. Chang, C. Y. Lin, C. W. Weng, M. Westerfield and H. J. Tsai*. 2007. Multiple upstream modules regulate zebrafish myf5 expression. BMC Dev. Biol. 7: 1-14 (SCI Journal)

34. Ho, Y. L., Y. H. Shau,L. C.Lin, P. J. Huang, F. J. Hsieh and H. J. Tsai*. 2007.In vivoassessment of cardiac morphology and function in heart-specific green fluorescent zebrafish. J. Formos. Med. Assoc. 106: 181-186.

35. H. C. Lee, J. N. Tsai, P. Y. Liao, W. Y. Tsai, K. Y. Lin, C. C. Chuang, C. K. Sun, W. C. Chang, H. J. Tsai.*. 2007. Glycogen synthase kinase 3alpha and 3beta have distinct functions during cariogenesis of zebrafish embryo. BMC Dev Biol. 7:93.

36. Holtzman, N. G., J. J. Schoenebeck, H. J. Tsai and D. Yelon*. 2007. Endocardium is necessary for cardiomyocyte movement during heart tube assembly. Development.134, 2379-86. (SCI journal)

37. Auman, H. J., H. Coleman, H. E. Riley, F. Olale, H. J. Tsai and D. Yelon*. 2007. Functional modulation of cardiac form through regionally confined cell shape changes. PLoS Biol. 5, e53. (SCI journal)

38. Wang, Y. H., C. K. Li, G. H. Le, H. J. Tsai * and Y. H. Chen*. 2008. Inactivation of the myogenic bHLH gene mrf4 in zebrafish leads to myofibril misalignment and motor axon growth disorganization in zebrafish embryos. Dev. Dynamics. 237, 1043-1050. (SCI journal)

39. Chen, Y. H.*, and H. J. Tsai *. 2008. Myogenic regulatory factors Myf5 and Mrf4 of fish: Current status and perspective. J. Fish. Biol. 73, 1-19. (reviewed and invited article)(SCI journal)

40. Chen, S. L., S. S. Li, R. Huang and H. J. Tsai *. 2008. Conditional production of a functional fish hormone in the transgenic line of Nannochloropsis oculata . J. Phycol. 44: 768-776. (SCI journal)

41. Li, S. S., and H. J. Tsai *. 2009. Transgenic microalgae as a non-antibiotic bactericide producer to defense the bacterial pathogen infection in fish digestive tract. Fish Shellfish Immunol. 26: 316-325. (SCI journal)

42. Tu, C. T., T. C. Yang and H. J. Tsai *. 2009. Nkx2.7 and Nkx2.5 function redundantly and are required for cardiac morphogenesis of zebrafish embryos. PLoS ONE. 4: e4249. (SCI journal)

43. Huang, H. Y., E. S. Dai, J. T. Liu, C. T. Tu, T. C. Yang and H. J. Tsai *. 2009. The embryonic expression patterns and the knockdown phenotypes of zebrafish ADP-ribosylation factor-like 6 interacting protein gene. Dev. Dynamics 238: 232-240. (SCI journal)

44. Fu, C. Y., H. C. Lee and H. J. Tsai* . 2009. The molecular structures and expression patterns of zebrafish tropoin Ⅰ genes. Gene. Expr. Patterns 9:348-56. (SCI journal)

45. Lin, C. Y., W. T. Chen, H. C. Lee, P. H. Yang, H. J. Yang and H. J. Tsai* . 2009. Transcription factor six1a plays function in craniofacial myogenesis of the zebrafish. Dev. Biol. 331:152-166. (SCI journal)

46. Hsu, R. J ., H. J . Yung and H. J. Tsai *. 2009. Labeled microRNA pull-down assay system: an experimental approach for high-throughput identification of microRNA-target mRNAs . Nucleic Acids Res. 37(10):77-87. (SCI journal)

48. Lee, H. C., W. A. Tseng, F. Y. Lo, T. M. Liu and H. J. Tsai*. 2009. Foxd5 mediates anterior-posterior polarity through upstream modulator fgf signaling during zebrafish s omitogenesis . Dev. Biol. 336:232-245. (SCI journal)

49. Ohn, J., H. J. Tsai and M. Liebling. 2009. Joint dynamic imaging of morphogenesis and function in the developing heart. Organognesis, 5:1-8. (SCI journal)

50. Lin, C. Y ., P. H . Yang, C. L . Kao, H. I. Huang and H. J. Tsai*. 2010. Transgenic zebrafish eggs containing bactericidal peptide is a novel food supplement enhancing resistance to pathogenic infection of fish. Fish Shellfish Immunol. 28: 419-427. (SCI journal)

51. Hsu, R. J., C. Y. Lin, H. S. Hoi, S. K. Zheng, C. C. Lin, H. J. Tsai*. 2010.Novel intronic microRNA represses zebrafish myf5 promoter activity through silencing dickkopf-3 gene. Nucleic Acids Res. 38, 4384-4393. (SCI journal)

52. Raeker, M. O .,  A. N. Bieniek, A. S. Ryan, H. J. Tsai ,  K. M. Zahn ,  M. W. Russell * . 2010. Targeted deletion of the zebrafish obscurin A RhoGEF domain affects heart, skeletal muscle and brain development. Dev. Biol. 337:432-443. (SCI journal)

53. Hsu RJ, C. C. Lin, Y. F. Su and H. J. Tsai * . 2011. D ickkopf-3-related gene regulates the expression of zebrafish myf5 gene through phosphorylated P 38a -dependent Smad4 activity. J Biol Chem . 286, 6855-6864. (SCI journal)

54. Chang SH, B. J. Lee, Y. D. Chen, Y. C. Lee and H. J. Tsai * . 2011. Development of transgenic zooplankton Artemia as a bioreactor to produce exogenous protein. Transgenic Res. (in press) (SCI journal)

55. Tu, C. T., T. C. Yang, H. Y. Huang and H. J. Tsai*. 2012. Zebrafish arl6ip1 is required for neural crest development during embryogenesis. PLoS One. 7, e32899. (IF:4.095; BIOLOGY 12/84)

56. Chen, Y. H., H. C. Lee, R. J. Hsu, T. Y. Chen, Y. K. Huang, H. C. Lo, S. C. Hu, H. J. Harn, J. R. Jeng, C. K. Sun, S. Z. Lin and H. J. Tsai*. 2012. The toxic effect of Amiodarone on valve formation in the developing heart of zebrafish embryos. Reprod Toxicol. 33, 233-244. (IF:3.266; TOXICOLOGY 20/83)

57. Fu, C. Y., Y. F. Su, M. H. Lee, G. D. Chang and H. J. Tsai * . 2012. Zebrafish DKK3a regulates the promoter activity of myf5 through interaction with membrane receptor Integrinα6b. J Biol Chem. 287: 40031-40042. ( IF: 4.651; BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY 62/290 )

58. Lin CY, Chen JS, Loo MR, Hsiao CC, Chang WY, Tsai HJ*. 2013. MicroRNA-3906 regulates fast muscle differentiation through modulating the target gene homer-1b in zebrafish embryos. PLOS ONE, 8, e70187.

59. Lin CY, Lee HC, Chen HC, Hsieh CC and Tsai HJ*. 2013. Normal function of Myf5 during gastrulation is required for pharyngeal arch cartilage development in zebrafish embryos. Zebrafish, 10, 486-499.

60. Lin CY, Lee HJ, Fu CY, Ding YY, Chen JC, Lee MH, Huang, WJ and Tsai HJ*. 2013. miR-1 and miR-206 target different genes to have opposing roles during angiogenesis in zebrafish embryos. Nature Communications, 4, 2829.

61. Lee HC, Lu BN, Huang HL, Chu C, Li HP, Tsai HJ*. 2014. Transgenic line huORFZ is an effective living bioindicator for detecting environmental toxicants. PLoS ONE, 9:e90160.

62. Chiang CY, Chen YL, Tsai HJ*. 2014. Different visible colors and green fluorescence were obtained from the mutated purple chromoprotein isolated from sea anemone. Marine Biotechnology, 16:436-446.

63. Lee HC, Lin YZ, Lai YT, Huang WJ, Hu JR, Tsai JN, Tsai HJ*. 2014. Glycogen synthase kinase 3 beta in somites plays a role during the angiogenesis of zebrafish embryos. FEBS Journal, 281:4367-83.

64. Shih CH, Chen HY, Lee HC, Tsai HJ*. 2015. Purple Chromoprotein Gene Serves as a New Selection Marker for Transgenesis of the Microalga Nannochloropsis oculata. PlosONE, 10:e0120780.

65. Chiang CY, Lee CC, Lo SY, Wang HJ, Tsai HJ*. 2015. Chromophore deprotonation state alters the optical properties of blue chromoprotein. PlosONE, 10: e0134108.

66. Lee HC, Su MY, Lo HC, Wu CC, Lo DM, Chao TY, Tsai HJ, Dai MS. 2015. Cancer metastasis and EGFR signaling is suppressed by Amiodaroneinduced Versican-V2. Oncotarget, 6:42976-42987.

67. Lee HC, Lo HC, Lo DM, Su MY, Hu JR, Wu CC, Chang SH, Dai MS, Tsai CT, Tsai HJ*. 2015. Amiodarone Induces Overexpression of Similar to Versican b to Repress the EGFR/Gsk3b/Snail Signaling Axis during Cardiac Valve Formation of Zebrafish Embryos. Plos ONE, 10:e0144751.

68. Fu CY, Wang PC, Tsai HJ*. 2016. Competitive binding between Seryl-tRNA synthetase/YY1 complex and NFKB1 at the distal segment results in differential regulation of human vegfa promoter activity during angiogenesis. Nucleic Acids Research, 45:2423–2437.

69. Chiang CY, Lin CY, Chen YT, Tsai HJ*. 2016. Blue Fluorescent Protein Derived from the Mutated Purple Chromoprotein Isolated from the Sea Anemone Stichodactyla haddoni. Protein Engineering, Design & Selection, 29:523-530.

70. Lin CY, Chiang CY, Tsai HJ*. 2016. Zebrafish and Medaka: new model organisms for modern biomedical research. J Biomed Sci, 23:19.

71. Zeng CW, Kamei Y, Wang CT, Tsai HJ*. 2016. Subtypes of hypoxiaresponsive cells differentiate into neurons in spinal cord of zebrafish embryos after hypoxic stress. Biology of the cell, 108:357-377.

72. Lin CY, He JY, Loo MR, Chang WY, Zeng CW, Tsai HJ*. 2017. microRNA-206 mediates boundary formation in newly forming somites through an Rtn4a/Cxcr4a/Thbs3a pathway. Open Biology, 7: 170009.

73. Lee HC, Fu CY, Zeng CW, Tsai HJ*. 2017. Embryonic expression patterns of Eukaryotic EndoU ribonuclease family gene endouC in zebrafish. Gene expression patterns, 26:66-70.

74. Lin CY, Lee HC, Wu JH, Tsai HJ*. 2018. Short fish-origin DNA elements served as flanking sequences in a knockdown cloning vector enabling the generation of a functional siRNA molecule in mammalian cells and fish embryos. Biochemical and Biophysical Research Communications, 505, 850-857.

75. Lin CY, Zhang PH, Chen YJ, Wu CL, Tsai HJ*. 2019. Conditional overexpression of rtn4al in muscle of adult zebrafish displays defects similar to human amyotrophic lateral sclerosis. Marine biotechnology, 21, 52-64.

76. Chang HY, Ko TP, Chang YC, Huang KF, Lin CY, Chou HY, Chiang CY, Tsai HJ*. 2019. Crystal structure of the blue fluorescent protein with a Leu-Leu-Gly tri-peptide chromophore derived from the purple chromoprotein of Stichodactyla haddoni. International Journal of Biological Macromolecules, 130, 675-684.

77. Lin CY, Wu CL, Lee KZ, Chen YJ, Zhang PH, Chang CY, Harn HJ, Lin SZ, Tsai HJ*.? 2019. Extracellular Pgk1 enhances neurite outgrowth of motoneurons through Nogo66/NgR- independent targeting of NogoA. eLIFE, 8:e49175.

78. Lee BC, Hung CW , Lin CY, Shih CH, Tsai HJ*. 2019. Oral administration of transgenic biosafe microorganism containing antimicrobial peptide enhances the survival of tilapia fry infected bacterial pathogen. Fish and Shellfish Immunology, 95:606-616.

79. Zeng CW, Sheu JC, Tsai HJ*. 2020. A new member of the forkhead box protein family in zebrafish: Domain composition, phylogenetic implication and embryonic expression pattern. Gene Expression Pattern, 35: 119093.