細胞老化(Cellular Senescence)
1. 粒腺體在崔發細胞老化上的分子機制。
2. 抑癌因子迴路P53-MDM2-Rb-P300/CBP、PTEN-AKT-TSCs-TORC在細胞老化的角色。

　　研究概況：

ㄧ、粒線體在細胞生長週期及細胞老化的角色

想法背景：

(1) 演化觀點： 粒線體共生理論真正的賽局是細胞自我複製時基因體競爭的衝突，而非能量效率的問題。 Stoichemistry 計算 glycolysis 經由 TCA cycle 產生 AT P ， 其效率為 18 倍。但 kinetics 計算 glycolysis 單位時間產生 ATP 效率為 TCA cycle 的 100 倍。不用提投資於形成粒線體以及因其所產生 ROS (reactive oxygen species) 需投資的防護機制的能量。癌細胞偏好使用 glycolysis 來源的能源 (Warburg effect) 顯示這種能量經濟學在增生能力上的優勢。

(2) 細胞週期觀點： 細胞週期是研究細胞「自我複製」的過程，包括 cell division cycle （簡稱 CDC ； 古典的細胞週期，以染色體複製分離的過程定義 phase ，如 G 1 、 S 、 G 2 、 M 等）與細胞生長週期 (cell growth cycle ； 簡稱 CGC) 。細胞週期中真正能「自我複製」的機器是 CGC ，染色體無法「自我複製」只能被複製，證據顯示細胞週期中 CDC 並無法 驅動 CGC 。相反的； CGC 則可以 驅動 CDC 。 CGC 驅動 CDC 的機制顯示一種平行但彼此互動控制的複雜過程。忠實性（ fidelity ）是所有所謂「複製」現象最核心的性質，且檢驗忠實性的機制須蘊藏於複製的過程中，而非複製結果的事後諸葛。 CDC 複製結果是染色體數目及其 genetic 及 epigenetic status 依照原式放大一倍，其中 忠實性 不止存在於結構部門也須兼及未來操作程序所顯現的功能部門。通常 忠實性檢驗機制伴隨複製的過程被活化，可以感知干擾並進行處置，因此複製及其調節系統共同決定複製結果的忠實性，換言之； CDC 忠實性檢驗機制內建於調節系統如何促進複製的作用機制之中。同理； CGC 「自我複製」忠實性的結果，如 粒線體數目、 ribosome 數目甚至 cell size ( 簡稱 SC) 等，其檢驗機制也應如是。細胞週期是研究細胞「自我複製」的過程，包括 cell division cycle （簡稱 CDC ； 古典的細胞週期，以染色體複製分離的過程定義 phase ，如 G 1 、 S 、 G 2 、 M 等）與細胞生長週期 (cell growth cycle ； 簡稱 CGC) 。細胞週期中真正能「自我複製」的機器是 CGC ，染色體無法「自我複製」只能被複製，證據顯示細胞週期中 CDC 並無法 驅動 CGC 。相反的； CGC 則可以 驅動 CDC 。 CGC 驅動 CDC 的機制顯示一種平行但彼此互動控制的複雜過程。忠實性（ fidelity ）是所有所謂「複製」現象最核心的性質，且檢驗忠實性的機制須蘊藏於複製的過程中，而非複製結果的事後諸葛。 CDC 複製結果是染色體數目及其 genetic 及 epigenetic status 依照原式放大一倍，其中 忠實性 不止存在於結構部門也須兼及未來操作程序所顯現的功能部門。通常 忠實性檢驗機制伴隨複製的過程被活化，可以感知干擾並進行處置，因此複製及其調節系統共同決定複製結果的忠實性，換言之； CDC 忠實性檢驗機制內建於調節系統如何促進複製的作用機制之中。同理； CGC 「自我複製」忠實性的結果，如 粒線體數目、 ribosome 數目甚至 cell size ( 簡稱 SC) 等，其檢驗機制也應如是。

( 三 ) 細胞老化觀點： 細胞老化的觀念始於 Hayflick and Moorhead (1961) 對 culture cells （ WI-38, human embryonic lung fibroblast cell line ）細胞自我複製次數極限的觀察（稱為 replicative senescence ），並以之做為個體老化的細胞學基礎。後來發現 stress 也可誘發細胞老化，稱為 premature senescence 。一般認為 replicative senescence 與 premature senescence 的誘發因子固然有別，但其造成老化的分子機制極為相似。因此；細胞老化及細胞凋亡是細胞自我複製機器對於忠實性受到 stress 挑戰後反應的終極處理形式。細胞週期中 apoptosis 的程序率由 CDC 發動，粒線體執行。細胞老化的執行機制在核內染色體，理該由粒線體發動。個體老化理論，例如 ROS 造成損壞累積理論、代謝率理論 … 等非程式老化理論都認為粒線體狀態是主要的原因。即使如程式老化理論（ Insulin/Insulin-like growth factor 訊息系統），粒線體對代謝的調控也扮演重要的角色。但細胞老化研究中諸多所謂 Hayflick factors 率多是核內細胞執行老化的分子機制本身，例如 p53 、 Rb 、 p16 INK 4a 、 PML-NB 、 oncogene （如 RasV12 ）、 telemere shorten-DNA damage 等等，而非真實的 Hayflick factors 。

研究成果：

建立粒線體發動的細胞老化系統 :

我們研究粒線體在細胞老化的角色上，以刺激胰臟 β-cell 分泌胰島素中粒線體扮演營養感知角色的研究為參考，利用正常人類胚胎纖維母細胞株 WI-38 建立以 AOA (amino-oxyacetate) 抑制粒線體 malate-aspartate shuttle 造成細胞老化的模式。 AOA 造成細胞老化徵狀包括 SA-β-gal (senescence-associated β-galactosidase) 染色、 SAHF (Senescence-associated heterochromatin foci) 的形成、 PML-nuclear body （ PML-NB ）的增大變多、以及 p16 INK 4a 增加、 p53 增加、 p21 增加， Rb hyperphosphorylation 下降。但 AOA 造成的細胞老化並沒有變大扁平而是狹長的細胞形態 (non-spreading morphology ) ， 我們觀察到 AOA 使得細胞生長週期細胞大小控制中調控生合成的中心調節者 mTORC1 活性消失；同時負責細胞骨架擴展體積的 mTORC2 則過度活化。根據 AOA 影響粒線體活性的可能機制，我們推想粒線體 α-ketoglutarate (α-KG) 減少可能是 AOA 造成 mTORC1 活性消失的原因，而以外加 α-KG 處理確實成功地阻卻 AOA 所造成的 mTORC 活性失衡以及細胞老化。我們也推想 AOA 使得粒線體減少 α-KG 的作用機制可能與胰臟 β-cell 相似，和粒線體在 CGC 的營養感知有關。 雖然效力較弱， 外加 3 倍的 NEAA (non-essential amino acids) 也會阻卻 AOA 所造成的 mTOR 活性失衡以及細胞老化。這些結果指向一個粒線體經由 α-KG 調控 mTORC1 活性的可能機制以及粒線體在 CGC 的胺基酸感知也扮演某種角色。

未來的研究方向：

(1) 粒線體在調控細胞生長週期上的角色探討

由於生長因子經由中心調節途徑 (TSC1/2-Rheb) 對 mTORC1 活性的調節在 mTORC1-S6K1 的負回饋控制下，但同時 mTORC1-S6K1 又是 CGC biomass 增加累積的主要調控者。所以 CGC biomass 增加累積期間，生長因子對持續的 mTORC1 活性在 mTORC1-S6K1 負回饋作用下不是主要調節機制。營養感知系統調控 CGC 進行期間 mTORC1 活性的維持是個早已熟知的事實，但其機制則未明。 CGC biomass 增加累積期間的 mTORC1 活性持續可能存在一個可以感知營養並自我維持的機制。基於 AOA 影響粒線體營養感知造成其減少 α-KG 使得 CGC 的 mTORC1 活性消失的推想，同時結合最近文獻報告有關 (1) c-Myc 與 HIF1α 相互拮抗調節粒線體活性， (2) c-Myc 與 HIF1α 蛋白質合成受 mTORC1/4E-BP 磷酸化的控制，以及 (3) HIF1α 分解系統的 proline hydroxylation enzymes (PHD) 需要 α-KG 做為共同受質等諸事實 ，我們架 構了一個以回饋迴路為基礎，且圍繞粒線體感知營養輸出 α-KG 調節 mTORC1 自我維持活性的工作模式。以此 mTORC1 經由回饋調控粒線體產生自我維持活性的全新觀點，可以利用操作此調節粒線體活性極便利的系統 (AOA/α-KG switch) 來研究粒線體在 CGC 進行 SC 時胺基酸感知並調控 mTORC 活性的作用機制。

(2) 粒線體調控細胞生長週期造成細胞老化機制之探討

如果粒線體是調控 CGC 的心臟，則 CGC 「自我複製」機器的忠實性檢驗機制將是誘發核內老化分子機制的啟動者，以忠實性檢驗機制內建於調節系統如何促進複製的作用機制之中的觀點；粒線體「自我複製」過程中其忠實性檢驗之分子機制顯然是研究細胞老化研究不可忽略的主題。回到演化的觀點；粒線體共生理論真正的賽局是細胞自我複製時基因體競爭的衝突，而非能量效率的問題。合作賽局的平衡點是染色體在 CDC 複製ㄧ次而且只能一次，粒線體在 CGC 也只能複製ㄧ次而且只能一次。失去合作賽局的平衡點才是細胞老化機制啟動的原因。只是粒線體以動態 fusion-fission cycle 群體形式存在，如何執行複製ㄧ次而且只能一次的合作賽局平衡將是個充滿挑戰的課題。且粒線體複製忠實性的事後判準是數目？粒線體 DN A ？ 粒線體 total mas s ？還是 粒線體活性？也可能是以上皆是。

二、濾泡刺激素（ FSH ）及轉型生長因子 TGF-β 誘發大鼠卵巢顆粒細胞分化之研究 ：基於動物飼養以及專業知識領域，這些工作皆在與陽明大學生理所 黃娟娟 教授長期合作下所完成。

(1) TGF-β 增強 FSH 對卵巢顆粒初級培養細胞的分化作用

TGF-β 透過增加 StAR （ Steroidogenic Acute Regulatory protein ）及 P450 SCC （ cytochrome P450 side chain cleavage enzyme ）的蛋白質表現量，增強了 FSH 所誘發的分化細胞合成分泌黃體素。 TGF-β 增強 FSH 的作用還包括刺激 63 、 67 、 92 （ proMMP 9 ） kDa gelatinase 分泌。此外； Androstenedione 也顯現與 TGF-β 類同的作用。

(2) 大鼠卵巢顆粒細胞的分化需要 gap junction 的功能

TGF-β 增強 FSH 的作用又增加一項：促使 gap junction 形成包括 connexin43 蛋白質的表現以及其被磷酸化（形成功能的 gap junction 所需過程）。 TGF-β 增強 FSH 的作用在形成功能 gap junction 的抑制劑 Lindane 處理下完全被阻斷，在蛋白質的表現方面 StAR 的抑制程度較小 ( 影響 TGF-β 增強 FSH 的作用，但不影響 FSH 單獨的作用 ) ， P450 SCC 及黃體素的分泌在 40μM Lindane 處理下則完全被抑制。

(3) Steroidogenesis 的基本細胞學問題

由於黃體素的合成經由先驅物膽固醇進入粒線體的 P450scc 及 3βHSD 作用而來，我們也轉向黃體素合成更基本的問題，包括調節膽固醇合成的問題（ 94 年度國科會計畫）以及 FSH ＋ TGF-β 的訊息傳遞系統調節合成黃體素的粒線體形成的問題 (95 年國科會計畫 ) 。

(4) TGF-β 增強 FSH 的作用的訊息傳遞問題

cAMP-PKA-CREB 與 PI3K-AKT-mTORC1 途徑交互作用既是 FSH 單獨也是 TGF-β 增強 FSH 作用的機制。但 FSH 調控增加 StAR 蛋白質表現量並不在此兩訊息途徑的控制下， FSH 對 450 SCC 蛋白質表現量並沒有影響，唯一受此兩訊息途徑的調控的 FSH 作用是增加 3β-HSD 蛋白質表現量。 TGF-β 增強 FSH 的作用則包括上述三個蛋白質表現量的增加，並且皆受此兩訊息途徑的調控。 TGF-β 並未增加 FSH 所誘發的 AKT 或 mTORC1 活性，但 rapamycin ( 一個常用的 mTORC1 抑制劑 ) 卻抑制只 TGF-β 增強 FSH 的作用，對 FSH 的作用並沒有影響。更奇怪的是 rapamycin 的作用形式：從 10 -20 到 10 -9 M 皆有?且效應全一樣。而在此系統 rapamycin 對 mTORC1-S6K1 活性的抑制卻需 10 -9 M 方才有效。 Rapamycin 的抑制形式 (specific and hypersensitive) 顯然蘊藏著 TGF-β 增強 FSH 作用的分子機制的秘密。

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