一、RNA去蓋頭酵素系統與果蠅oskar信息RNA在卵母細胞後端定位的調控機制
二、果蠅高基氏體蛋白質Rotini與v-SNARE 在HSPGs生成過程的功能探討
三、 TGF-B訊息路徑與大腸直腸癌變機制的探討

人類疾病與致病基因的篩選與其功能性研究，由於系統的限制，多借用可操作基因組成的動物模式來瞭解其可能的活體機制。百年來，人們以果蠅 (Drosophila melanogaster)為遺傳學研究與教學的最基礎素材。近二十幾年來，由於分子生物學的引進，果蠅的分子發育遺傳學研究更進入了一新紀元。因作用機制的演化保守性，由果蠅的研究，人們更了解人類的疾病與癌症許多是由控制發育機制的基因突變所衍生。比如，大腸直腸癌的起始機制即因研究果蠅胚胎腹部分節形成的Wingless路徑相關基因而瞭解其複雜運作。這些豐碩研究成果主要是來自於1995年諾貝爾醫學獎得主Dr E. Weischaus與Dr. C. Nusslein-Volhard所作的遺傳搜尋，並由後續者研究所找到的合子基因(zygotic gene)與母源基因(maternal gene)之發育遺傳功能所獲至。

胚胎發育的機制，主要由雌果蠅的母源成份（maternal components,即由母源基因所合成的基因產物）和受精後的合子基因的共同作用而主宰胚胎發育的進行。母源基因所合成與控制的母源成份（主要是mRNA與蛋白質）首先佈建胚胎的空間架構、進而控制合子基因的基因表達。因此，了解母源基因的數目、種類、與其所作用的範圍與機制乃是了解胚胎發育的根本源頭。但是，兩位諾貝爾獎得主所搜尋到的母源基因，由於技術面的限制，只取得了少部分的結果。為了突破此技術限制，筆者於1990年起在哈佛醫學院遺傳學系，以四年的時間，建立了現今果蠅遺傳學界普遍使用的高效率種細胞基因重組 (germline cell genetic recombination) 方法。奠基於此，本研究室的研究方向為以此技術在果蠅基因體進行特定功能性基因的搜尋與研究，並以之作為尋找人類疾病與致病同源基因的基礎，進而以果蠅模式研究人類癌症基因的作用機制。

研究設計

隨著當代基因體計劃漸次完成後，基因的功能性訊息多以跳躍元素(Tn 、Retrovirus或P 跳躍元素) 對特定生物體作系統化的突變搜尋而迅速取得; 而這些經設計的跳躍元素可用於迅速取得突變基因位附近的細胞DNA序列，有效的克服往日在分子選殖的困難。如此，在功能性基因的研究上，經系統化搜尋後，對特定的發育與生理路徑的成員與交互作用的關係將可取得宏觀的視野，並加速各項研究的進行。

依此設計，我們首先建構了果蠅界唯一在P跳躍元素造成突變後可以立即進行基因重組分析的第二條染色體，cFRT2L2R。利用此獨特的染色體，我們以位在X染色體的P跳躍元素作為突變劑、取得位在cFRT2L2R 染色體的突變株、決定此突變是否為必須基因被P跳躍元素阻斷所造成的同源致死性狀、以種細胞株重組技術分析突變基因可能具有的母源功能、再以分子生物技術(如質體救援plasmid rescue或IPCR方法)取得P跳躍元素的嵌入位置DNA片段、配合序列分析與果蠅基因體訊息我們可以立即取得突變基因的定位與基因的分子特性與功能性狀的相關性。這項已經取得美國界專利的新技術將比歐美採用筆者原先所建立的技術有至少五至七倍的較高效率。

由於功能性基因並非單一物種所專有，依據演化保守性，生物資訊分析方法的運用將可以幫助我們取得同源人類功能基因的基礎敘述。由基因體計劃的推算，66%具有功能性狀(包括同源致死性、不孕性、及其他可見性狀)的果蠅基因可以在高等動物(包含人類)中取得同源基因。果蠅第二條染色體上估計有1,400個必須基因，其中至少900個具有特殊母源功能參與種細胞的分裂生長、卵的生成與特定的胚胎發育過程。由估算，面對全世界的競爭，在每一個所搜尋到的突變基因中，利用cFRT2L2R的優勢可以幫助我們爭取約50-60%研究新基因的機會;除去可能已經完成的基因功能搜尋，這項新技術更能幫助我們爭取研究約250個新的人類基因。

研究現況

目前實驗室主要在研究

1. 果蠅信息核糖核酸裂解體與去蓋頭酵素1的探討
2. 果蠅去蓋頭酵素 2的發育角色探討
3. TGF-B訊息路徑與大腸直腸癌變機制的探討

1. 果蠅信息核糖核酸裂解體與去蓋頭酵素1的探討

果蠅去蓋頭酵素1，dDcp1，是oskar 信息核糖核酸在後端定位與裂解所需要的(Developmental Cell, in press)；只有包含dDcp1的信息核糖核酸裂解系統的osk核糖核酸複合體可以被送到卵母細胞的後端，這用以確保oskar 信息核糖核酸在轉譯以後的正確裂解。

dDcp1在護衛細胞質中有特地位置的分布，並不是均勻的散落在整個細胞質。這分佈狀態與哺乳類與酵母菌中信息核糖核酸裂解時所座落在細胞質中的特定裂解體(Processing Boides, P Bodies)的分佈型態是類似的。此計畫將以定義尚未為果蠅界所敘述的裂解體為第一項目標。由初步分析我們已確定dDcp1與dDcp2，Me31B，Pacman在護衛細胞中有共同重疊的免疫染色位置，這符合信息核糖核酸裂解體的定義。當信息核糖核酸裂解步驟被干擾時，預期裂解體將產生數量與大小的動態變化。這可以操作相關基因諸如dDcp1或Pacman的突變來加以觀察。使用預期在卵發育期中能夠被迅速裂解的信息核糖核酸可以用於觀察此信息核糖核酸是否進入裂解體中。更重要的，我們將追蹤oskar 信息核糖核酸由卵母細胞轉換到胚胎發育初期時由極顆粒(Polar granule)到裂解體的變化；這項實驗將提供裂解體在發育過程中的轉換訊息。

此計畫的第二項目標是進一步探討dDcp1如何與其他成員作用以調控oskar 信息核糖核酸得傳輸。遺傳修飾者搜尋與酵母菌雙雜交搜尋將嘗試探討與dDcp1相互作用的新因子。我們亦將詢問兩個dDcp11可能的作用者，Me31B 和Pacman。Me31B 的酵母菌同源蛋白 Dhh1p能夠刺激信息核糖核酸的去蓋頭反應以及參與Dcp1的作用。Pacman為果蠅Xrn1外切核糖核酸裂解酵素。以生化以及遺傳的方法。我們將試問此兩個候選作用者在oskar 信息核糖核酸後端定位的可能角色。

在學界，我們首先提出果蠅去蓋頭酵素1與信息核糖核酸裂解系統參與oskar 信息核糖核酸的後端傳輸與定位，預期將對相關細胞生物學與信息核糖核酸領域產生重大衝擊。此一研究計畫書旨在繼續闡明其後的詳細機制以維持在此課題研究的領先地位。

2. 果蠅去蓋頭酵素 2的發育角色探討

5’ 端蓋頭結構的去除是信息核糖核酸裂解的一重要步驟。在真核細胞中演化保守的兩個去蓋頭酵素1 與2 蛋白質以總酵素(holoenzyme)的方式一起作用。去蓋頭酵素2 是總酵素中具有去蓋頭催化功能的蛋白次體，而以一至今未明瞭的機制，去蓋頭酵素1則是促進去蓋頭活性的結合蛋白因子。

吾人先前指出在發育功能上，果蠅去蓋頭酵素1，dDcp1，是osk mRNA 坐落於卵細胞後端與其裂解所需要的重要成員(Developmental Cell, in press). 至今果蠅去蓋頭酵素2，dDcp2在發育過程中的角色依舊未明。在我們的初步實驗中，dDcp2 突變也呈現出典型的胚胎後端突變性狀。這一計畫將以釐清果蠅去蓋頭酵素2，dDcp2，是否也是osk mRNP 複合體中的成員為主要目標。

我們正進行分析已經搜尋到的新dDcp2基因型式( allele)，包括null 與弱 P 嵌入突變；也將利用不同基因體序列片段以檢驗互補測試並確認由dDcp2 基因所造成的突變性狀。除了現有二個抗體外，更進行重復抗原的抗體製造以取得正確的dDcp2蛋白質表現型態。在卵發育中，dDcp2 基因的發育角色將被探討，尤其是dDcp2 與osk mRNP 複合體形成與坐落的關係。

在學界，我們首先提出果蠅去蓋頭酵素1與信息核糖核酸裂解系統參與oskar 信息核糖核酸的後端傳輸與定位。對於與果蠅去蓋頭酵素1形成複合體的果蠅去蓋頭酵素2的研究，預期將對相關細胞生物學與信息核糖核酸領域產生重大衝擊；此一研究計畫書旨在繼續闡明其後的詳細機制以維持在此課題研究的領先地位。

3. TGF-B訊息路徑與大腸直腸癌變機制的探討

大腸直腸癌癌變基因的致病機轉，一直被認為是癌症遺傳學在人體細胞腫瘤癌變發生過程中是最具經典的研究? 除了它本身在已開發國家中居高不下的發生率外，相較於其他的癌腫瘤組織而言，它的癌變發生過程相當長，很容易在手術操作時觀察到呈現各個不同時期的腫瘤組織;加上現在已知許多基因的異常直接牽涉到大腸直腸癌的發生，因而建立了一般人所熟知的腺瘤--腫瘤序列學說。然而臨床上實際取得的腫瘤組織卻是非常多樣性的，它們可以是型態迥然不同的大腸直腸癌腫瘤，也可以是不同嚴重程度的大腸直腸癌腫瘤；因此，大腸直腸癌之癌變機轉絕非單一遺傳途徑? 過去幾年來，我們和長庚醫院大腸直腸外科醫師與基礎醫學研究人員曾就Wingless signaling pathway基因在大腸直腸癌癌變途徑的角色進行詳細的分析，證實了不同生長型式之大腸直腸癌的發生，乃經由不同遺傳變異之組合。而TGF-B訊息路徑將是我們下一個努力的目標；尤其dDcp1的人類同源蛋白hDcp1a，除了其去蓋頭的功能以外，更已經被證實是TGF-B訊息路徑中Smad4的結合蛋白質，亦被稱為SMIF(Smad4 Interaction Factor)。在果蠅系統中dDcp1在in vitro 下亦具有轉錄活化因子的特性(unpublished)。在人類染色體上18q21.1區域發生核酸序列缺失也是大腸直腸癌腫瘤形成過程中常見的一種現象，而座落於本區域參與轉形生長因子訊號傳遞的Smad4基因被認為可能具有抑制癌變發生的功能?而癌變之後期和癌轉移期經常伴有高頻度的Smad4基因突變率發生? 我們將探討類臨床上常見之不同類型的大腸直腸癌樣品，分析Smad4與SMIF相關基因的突變情形，探討其可能作用機制，以進一步了解癌細胞病變的學理基礎?

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